Métodos actuales de extracción de ácidos nucleicos

Métodos actuales de extracción de ácidos nucleicos

PARTE 1

La extracción de ácido nucleico (NAE) es uno de los pasos más fundamentales en la biología molecular y se utiliza de forma rutinaria en muchas áreas de las ciencias biológicas y médicas, ya que este procedimiento marca un punto de partida en cualquier kit de diagnóstico molecular [1].Este procedimiento crucial se conoce desde hace más de un siglo y se ha desarrollado sustancialmente en las últimas décadas.Sin embargo, aún es necesario lograr algunos avances para que los protocolos NAE abandonen los entornos de laboratorio y pasen al 'mundo real' de los diagnósticos en el lugar de atención (POC-Dx).

Hoy en día, se sabe que los ácidos nucleicos (NA) intracelulares pueden clasificarse ampliamente en genómicos (o cromosómicos), plásmidos y diferentes tipos de ARN.Aunque los ARN poseen uracilo mientras que los ADN presentan timina, los ácidos nucleicos exhiben propiedades bioquímicas básicas similares, pero pueden tener estructuras tridimensionales bastante distintas (genómicas, plásmidas, ARNt, ARNm, ARNr, etc.).Sin embargo, a pesar de las diferencias estructurales, los métodos más utilizados descritos en el presente texto se pueden aplicar al ADN en sus múltiples formatos organizativos (cromosómico, plásmido, etc.), así como al ARN y sus formatos multidimensionales (ARNm, ARNr, ARNt). , miARN, etc.) con modificaciones menores.

NAE se puede dividir aproximadamente en cuatro pasos, que se pueden modular según la muestra y las aplicaciones posteriores: (i) alteración celular;(ii) eliminación de lípidos, proteínas y otros ácidos nucleicos de la membrana, (iii) purificación/unión de ácidos nucleicos a granel;y (iv) concentración de ácido nucleico.

La disrupción o desintegración celular se puede lograr mediante métodos físicos y/o químicos, cuyo objetivo principal es alterar la pared celular y/o las membranas celulares.Los métodos de alteración se basan principalmente en las propiedades de la muestra y, para este fin, se utiliza una amplia gama de herramientas y enfoques, ya sea solos o combinados, para lograr la alteración del tejido/célula.Las enzimas líticas, los agentes caotrópicos y diferentes tipos de detergentes son los componentes principales de la lisis química, mientras que el método mecánico altera las células triturando, cortando, golpeando con perlas y aplicando choques.Es interesante observar que si una técnica no produce buenos resultados, otra puede resultar exitosa.Los métodos de choque osmótico han dado, en ciertos casos, mejores resultados que los protocolos comunes de purificación de NA, como la extracción con fenol-cloroformo y el batido de perlas.La alteración celular no sólo es importante para la extracción de ADN, sino que también desempeña un papel crucial en la industria biofarmacéutica, ya que muchas proteínas recombinantes y otros componentes importantes de la célula pueden recuperarse mediante este proceso.Otro enfoque para la alteración celular es el uso de diferentes métodos en combinación.Un buen ejemplo es el caso de la lisis enzimática, donde muchos protocolos utilizan proteasas para liberar la NA de su armazón proteico protector.Además, la inactivación de las nucleasas celulares que quedan libres en solución para proteger la nueva NA libre de proteínas es crucial.Se utiliza una combinación de detergentes y sales caotrópicas en una única solución para solubilizar la pared celular o la membrana celular e inactivar las nucleasas intracelulares.La disrupción mecánica, por otro lado, utiliza la fuerza para extraer los componentes de la célula.Un ejemplo clásico de molienda en biociencias es el uso de mortero, que hoy en día se optimiza con el uso de nitrógeno líquido (cuando lo permite la muestra).Las paredes celulares también pueden verse alteradas por las ondas de choque creadas por cambios rápidos de presión provocados por la sonicación o la cavitación.Otras herramientas mecánicas disponibles para la ruptura celular son el corte, que utiliza una fuerza tangencial para hacer un agujero en la célula, y el batido de perlas, que utiliza diferentes perlas de vidrio o acero para romper la pared celular resistente, como se mencionó..

Los métodos NAE abarcan la extracción tanto de ADN como de ARN, pero se pueden caracterizar de manera más amplia como métodos impulsados ​​químicamente o en fase sólida;ambos contienen los cuatro pasos mencionados anteriormente.En las siguientes secciones, revisaremos el principio de funcionamiento y/o la justificación de los principales métodos utilizados hoy en día en las ciencias biológicas y médicas.Dado que el diagnóstico molecular depende en gran medida de técnicas que comienzan con NAE, también discutiremos algunas de las características básicas de los dispositivos disponibles para POC-Dx, culminando con los desafíos y limitaciones de adaptar los métodos NAE a las pruebas de diagnóstico en el lugar de atención.