La tecnología de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un elemento básico de innumerables laboratorios de investigación y pruebas, en una variedad de campos que incluyen biomedicina, diagnóstico clínico, pruebas de microbiología de alimentos y ciencia forense criminal.Esta tecnología fundamental utiliza ciclos térmicos para facilitar una serie de reacciones en las que una muestra de ADN se replica rápida y exponencialmente para producir millones o miles de millones de copias de secuencia.Al adquirir un nuevo sistema de PCR, es importante considerar los objetivos finales de su aplicación, la precisión y eficiencia del equipo de ciclo térmico y la capacidad y flexibilidad del instrumento.Este artículo ofrece una descripción general de las diferentes opciones y características disponibles para los sistemas de PCR para ayudar a seleccionar un sistema adecuado para su aplicación.
1. PCR frente a qPCR frente a dPCR
Si bien todos los sistemas de PCR replican el ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa, existen diferentes metodologías utilizadas por diferentes sistemas para lograr resultados específicos.Entre estos diferentes métodos se encuentran la PCR estándar, la PCR cuantitativa (qPCR) y la PCR digital (dPCR).
Las máquinas de PCR estándar se utilizan normalmente para amplificar el ADN para su uso y pruebas posteriores;en cierto sentido, esta tecnología se utiliza como un medio para generar un producto final más que como un método de prueba analítico en sí.El ADN amplificado se puede medir sólo después de que la reacción de PCR esté completa, en lugar de en tiempo real, y por lo tanto, este método a veces se denomina PCR de punto final.El producto final de la amplificación por PCR tradicional se usa comúnmente para la clonación y secuenciación posteriores, y también se puede verificar mediante electroforesis en gel para confirmar la presencia de secuencias objetivo y su cantidad relativa a baja resolución (según la intensidad de la banda).
Para una cuantificación más rápida y precisa de la cantidad de secuencia objetivo presente en una muestra, la PCR cuantitativa (qPCR), también conocida como PCR en tiempo real, utiliza sondas fluorescentes durante el proceso de amplificación para controlar la cantidad de ADN presente después de cada ciclo térmico.Al observar cuántos ciclos se necesitan para alcanzar un cierto umbral de intensidad de fluorescencia, el analista puede determinar la cantidad de ADN en el material de partida al comparar los resultados con una curva estándar.La qPCR también puede confirmar la presencia o ausencia de una secuencia objetivo más rápidamente que la PCR de punto final y, por lo tanto, se utiliza en aplicaciones de diagnóstico como la detección del SARS-CoV-2 (utilizando la transcripción inversa para convertir primero el ARN viral en ADNc).
La PCR digital (dPCR) es otro método cuantitativo en el que las reacciones de PCR tienen lugar en miles de cámaras de reacción separadas, y el número absoluto de moléculas de ADN en la muestra original se puede determinar en función de cuántas cámaras de reacción producen una señal fluorescente una vez completada la amplificación. .A diferencia de la qPCR, las mediciones de fluorescencia no se realizan en tiempo real y no se necesita una curva estándar para cuantificar el ADN de la muestra.Si bien la dPCR generalmente tiene un rendimiento limitado y costos más altos que la qPCR, es más precisa, sensible y exacta en la cuantificación del ADN y es especialmente útil en aplicaciones como la detección de mutaciones raras y polimorfismos de un solo nucleótido (SNP).
La determinación de si se elige una PCR de punto final (cualitativa/semicuantitativa) versus un método cuantitativo (qPCR o dPCR) es relativamente sencilla cuando se considera su aplicación, pero la elección entre qPCR y dPCR puede tener más matices.La qPCR es de alto rendimiento, rentable y suficientemente sensible para muchas aplicaciones, pero la dPCR puede ser una mejor opción si la cuantificación absoluta con límites de detección bajos es primordial.
2. La importancia del control de la temperatura
La capacidad de los termocicladores para ajustar y controlar de manera precisa y eficiente la temperatura de las muestras es lo que permite el éxito de las reacciones de amplificación y debe ser un enfoque central al seleccionar cualquier sistema de PCR.Diferentes sistemas pueden ofrecer diferentes capacidades con respecto a velocidades de rampa, uniformidad y precisión de la temperatura, y la capacidad de lograr gradientes de temperatura entre bloques térmicos para ayudar a la optimización del método de PCR.
La velocidad de rampa se refiere a la velocidad de los cambios de temperatura entre los pasos del ciclo térmico y generalmente se expresa como grados Celsius por segundo (°C/seg) en las especificaciones del instrumento.Los fabricantes pueden proporcionar información sobre velocidades de rampa máximas y velocidades de rampa promedio, así como diferenciar entre velocidades de rampa ascendentes (calentamiento) y velocidades de rampa descendentes (enfriamiento) de un instrumento.En general, velocidades de rampa más altas corresponden a tiempos de ejecución más rápidos, pero los compradores deben tener cuidado de centrarse en velocidades de rampa máximas sin examinar otras métricas relacionadas con la velocidad del instrumento.Es posible que un instrumento solo alcance su velocidad de rampa más alta durante un corto período de tiempo, y la velocidad de rampa promedio reflejará mejor el ritmo de los cambios de temperatura.Si bien las especificaciones de velocidad de rampa pueden dar una idea general de qué tan rápido pueden funcionar ciertos instrumentos, cuando sea posible, busque datos sobre tiempos de ejecución reales demostrados en un instrumento para obtener una imagen realista de cómo las altas velocidades de rampa se traducen en análisis rápidos.
La precisión y la uniformidad de la temperatura también son clave para reacciones exitosas y, si bien todos los termocicladores están diseñados para producir las temperaturas necesarias para la PCR, ciertas características pueden ofrecer un mayor grado de confianza, lo cual es fundamental para aplicaciones en las que las muestras pueden ser limitadas y los resultados confiables son de suma importancia, como en el diagnóstico clínico y la medicina forense.El control preciso de la temperatura también es crucial cuando se utiliza la máquina de PCR para técnicas sensibles como el análisis de fusión de alta resolución (HRM).Una tapa calentada puede garantizar una mejor uniformidad de la temperatura en todo el tubo de PCR, ya que sin una tapa calentada, la muestra puede evaporarse y condensarse en la parte superior del tubo, donde la temperatura es más fría.El diseño del bloque térmico también afecta el control de la temperatura;Los bloques de aluminio son la opción más económica pero son los menos conductores, lo que significa que alcanzarán la uniformidad de la temperatura más lentamente y tendrán velocidades de rampa más bajas que los bloques más conductores.Los bloques recubiertos de plata y oro son más caros pero permiten que la transferencia de calor se produzca más rápidamente, lo que garantiza una distribución uniforme de la temperatura en todo el bloque.
Diferentes objetivos de ADN pueden requerir diferentes temperaturas para lograr los mejores resultados de amplificación;por ejemplo, las secuencias ricas en GC necesitan temperaturas más altas para la desnaturalización.Las temperaturas de recocido ideales también se ven afectadas por una variedad de factores: mientras que las temperaturas para este paso generalmente se seleccionan en función de las temperaturas de fusión de los cebadores, las diferencias en las temperaturas de fusión entre los pares de cebadores y la influencia de la concentración del reactivo, el pH y la concentración de sal pueden afectar hacen que la optimización de las condiciones de temperatura de reacción sea una tarea complicada. Las máquinas de PCR con capacidad de gradiente de temperatura están diseñadas para ayudar en la optimización de los métodos de PCR al permitir probar múltiples temperaturas de recocido en una sola ejecución.Dependiendo de los tipos y la diversidad de muestras que planee analizar usando su máquina de PCR, elegir un instrumento con capacidades de gradiente puede valer el costo adicional para ahorrar mucho tiempo y reactivos optimizando nuevos protocolos en menos ejecuciones.
3. Bloques térmicos
Como se mencionó, el bloque térmico utilizado con un instrumento de PCR puede marcar la diferencia en el control de la temperatura, pero el diseño del bloque (y el diseño del instrumento para acomodar diferentes bloques) también afecta el rendimiento, los costos de los consumibles y la flexibilidad.Los bloques típicos vendrán en formato de 96 o 384 pocillos, aunque también están disponibles otros formatos como 48 y 1536 pocillos.Un mayor número de pocillos permite un mayor rendimiento con menores volúmenes de reacción, lo que inicialmente será más costoso pero, en última instancia, reducirá el precio por reacción debido al menor volumen de reactivo utilizado para cada pocillo.Tener en cuenta cuántas muestras procesará y con qué frecuencia utilizará la máquina determinará si un bloque térmico con un recuento de pocillos mayor o menor será más práctico y rentable para su laboratorio.
Algunos instrumentos vienen con un formato de bloque fijo, mientras que otros permiten el uso de bloques intercambiables, lo que ofrece más flexibilidad para cambiar entre formatos de 96 y 384 pocillos o entre diferentes materiales de bloque para diferentes aplicaciones.Algunos termocicladores también admiten varios bloques en el mismo instrumento, lo que permite ejecutar diferentes protocolos en diferentes conjuntos de muestras al mismo tiempo.3 Los bloques con dimensiones 'universales' mejoran aún más la flexibilidad para usar tubos, tiras o placas de PCR de diferentes tamaños según sea necesario.
Debido al papel clave de este componente en el control de la temperatura, el manejo de muestras y el rendimiento, se deben considerar cuidadosamente las opciones del bloque térmico al seleccionar un termociclador.Para laboratorios con un volumen bajo de muestras, o aquellos que realizan habitualmente solo un puñado de ensayos, pueden ser suficientes instrumentos de bloque fijo de menor costo con un formato estándar de 96 pocillos.Sin embargo, los instrumentos modulares y flexibles pueden ser ventajosos para laboratorios con una mayor cantidad de protocolos, volúmenes de muestra variables y más usuarios que dependen del mismo instrumento para sus propios ensayos, así como para laboratorios que deseen ampliar su capacidad de rendimiento en el futuro.
1. PCR frente a qPCR frente a dPCR
